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黑水虻(Hermetiaillucens):一种可持续的蛋白质、脂质和生物活性物质来源
 
Ariane Muller, Diana Wolf 和Herwig O. Gutzeit著易昌金,乔国贤,李国明译
 
摘要:现有农业土地的集约化使用也无法满足全球范围内人们对蛋白质和脂肪日益增长的需求。由于种种原因,通过昆虫的规模养殖来获取蛋白质和脂肪来源而备受关注。黑水虻是一种具有很多有益属性的昆虫,其幼虫可以用做生产脂肪和蛋白质。此外,黑水虻幼虫还可能产生对人和动物福利有益的活性物质。

关键词:抗菌肽;枯草芽孢杆菌;生物膜;黑水虻;昆虫文化;昆虫蛋白和脂肪

1如何利用昆虫减少世界范围的蛋白质和脂肪紧缺
现有农业土地的集约化使用无法满足全球范围内人们对蛋白质和脂肪日益增长的需求。蛋白质和脂肪的过度需求,导致了生态系统的破坏。南美大豆生产的扩张和热带亚洲国家棕榈油行业的蓬勃发展使得生态问题显得尤为突出。热带森林的刀耕火种生产模式已被关注多年,尽管情况十分不理想,一种可持续的替代蛋白质和脂肪的产品还没有出现。生态问题限制了生产越来越无法满足蛋白质和脂肪日益增加的缺口。那么有没有可能在不使用土地的情况下生产出具有价值的有机原料呢?通过昆虫的规模养殖来获取蛋白质和脂肪来源已经成为人们关注的焦点。昆虫可以通过各种来源的有机垃圾饲养。昆虫是高效的饲料转换器,而且相对猪和牛养殖来说,产生较少的对气候造成破坏的温室气体,且耗水量小,造成人畜共患病的风险低。一些昆虫作为人类的食物有很长的历史,但高质量的昆虫蛋白也可以被提取出来,作为人类食品的组成部分。此外,昆虫蛋白在大豆和鱼粉替代中也扮演着重要的角色。从昆虫中获取的脂类可以取代棕榈(仁)油,从而有助于保护热带森林。
黑水虻(双翅目:水虻科)是一种具有多种有益属性的昆虫(图1)。长度可达20毫米。该物种在热带和亚热带地区流行,也存在于南欧和巴尔干半岛的部分地区。它几乎可以在所有的有机物上进行大规模养殖。即使动物的粪便也可被其幼虫吞食,而且大约有50%的贫乏基质被转换为幼虫的生物质。黑水虻产卵适宜温度为28 ℃,幼虫在48小时内孵化,大约两周后离开泥浆寻找干燥的地方化蛹,再过两周后孵化为成虫,成虫没有口器,不能进行摄食、咬或刺等行为,所以无法成为疾病的载体。黑水虻的喂养也仅限于幼虫阶段。较高的产卵量(500至1000)、短暂的生命周期和简单的饲养条件,使得这些幼虫作为爬行类动物和鱼类的绝佳饲料,在养殖管理和水族馆中很受欢迎。
 
图1.黑水虻(Hermetiaillucens)(A)成虫,(B)预蛹前期幼虫[图片提供:Hluschi&Gutzeit].
Sheppard率先开展了对黑水虻的研究工作,他认为黑水虻作为畜禽饲料的应用可追溯到40多年以前。高品质的黑水虻干虫与豆粕具有竞争性。杂食性黑水虻的应用也被报道,它们可以被用于减少粪便中的氮含量。将黑水虻放在马厩的粪肥中繁殖也可以控制家蝇的数量。此外有人表明,黑水虻幼虫可以降低家禽粪便中的细菌(大肠杆菌和沙门氏菌)数量。
在小范围内,通过利用黑水虻降解废物的特性,可开发家庭堆肥设施(Biopod™)。黑水虻在昆虫学中也可用来估计死亡间隔。此外,黑水虻对于开发生物柴油产品的应用研究也在进行中。
近年来,许多公司都在尝试优化和提高黑水虻的养殖技术从而促进其商业应用。蛋白质和动物饲料的生产一直是世界各地许多公司的关注重点,例如HermetiaBaruth公司(德国),AgriProtein技术有限公司(南非),Enterra饲料公司(加拿大)等已经实现了黑水虻的大规模养殖。根据IlkkaTaponen的昆虫学数据库显示,全球共有289家昆虫公司,其中222家是“活跃的”。大多数提供“黑水虻”产品的公司都位于欧洲地区,但也有澳大利亚、非洲、亚洲和美国提供这些产品。不幸的是,欧盟法律禁止将动物产品(包括昆虫)作为饲料用于食品生产,这也是进行商业化运作的障碍。
2016年9月,欧盟卫生与食品安全理事会(European Commission Directorate-General)发起了与欧盟成员国的讨论,关于授权使用昆虫蛋白作为水产养殖鱼类的饲料。为此,欧盟执委会制定了一系列建议,旨在修订欧洲共同体现行规定(传染性海绵状脑病和动物副产品)。在2017年5月24日,欧盟授权使用昆虫蛋白作为水产养殖的饲料。欧盟委员会正式通过了2017 / 893号决议,该决议从2017年7月1日起生效。这一授权仅限于包括黑水虻在内的七个物种的名单,而且这些物种必须达到“饲料级”才能被饲用。位于欧盟以外的公司,如Enterra饲料和AgriProtein,已经在欧盟当地市场提供了一些昆虫产品,如整只的干虫幼虫、虫油(即MagOil™)、烘干蛋白粉(即MagMeal™)、幼虫油、肥料(即MagSoil™和Soil+)。
2通过规模化养殖黑水虻获取可持续的蛋白质和脂肪资源
如何在不占用农业土地的前提下,通过黑水虻可持续生产蛋白质和脂肪呢?我们已经专门建立了一个仅使用次生资源生产黑水虻的小型实验基地。可持续生产原理见图2。生产黑水虻所需能源来自于标注a的沼气设施产生的多余能量。我们的目标是建立一个只利用二次资源的闭合生产单元,该单元为替代应用投入很少或不投入(能量或有机废物)。在我们的计划中,即使是幼虫粪便(幼虫的粪便)也可以在沼气设施中作为肥料回收利用。
图2在生产系统内利用废弃资源生产黑水虻幼虫.300吨的有机物可以生产120吨的黑水虻幼虫.沼气的废热可以用于大众能源,幼虫粪便可直接回收生产沼气或直接用作肥料.生产过程中基本不会产生任何浪费.
由于幼虫通常生活在被微生物高度污染的底物上,一些研究表明,黑水虻幼虫影响其“饲料和粪便”中细菌和寄生虫的摄食活动。当使用幼虫作为饲料时,幼虫微生物菌群应该被控制以避免被病原菌侵袭。
大规模生产黑水虻幼虫在原理上是非常简单的。然而,对于大规模生产来说,养殖的安全和效率是重要的,这需要具备动物学背景和技术专长。在温度、湿度和光线最佳的条件下,成年动物被关在飞行笼里。用合适的工具收集数百个沉积在特殊部位的卵,大约两天后幼虫孵化。幼虫被放置在用平底容器盛装的饲料中。容器内的温度和湿度必须控制,幼虫密度也很重要。理想情况下,所有食物都是供幼虫摄取的。黑水虻的代谢活动是强烈的,因此肯定会产生许多的代谢能量。在养殖容器中,幼虫倾向于集中在饲料周围,我们测了一下温度超过45度(图3)。由于温度差异不能够被搅拌或者摇晃所阻止,所以其生长也不能表现出完美的一致性。
图3,采食香蕉片黑水虻虫基的温度记录,组内温度超过45℃(照片提供:Mueller2016; VarioCAMHD research 980 kindly provided by InfraTec GmbH.)
 
大约两周后,幼虫到达了蛹的状态,然后离开了已经变成液体粪便的饲料。在这个阶段,幼虫较为容易收集,如果饲料容器的设计提供了一个干燥的迁移路径,那么幼虫可以在没有任何其他污染的情况下收获。当然对于大规模生产,也可以采用其他方法。
在法律允许的情况下,黑水虻幼虫可以直接作为鸡饲料使用,不需要进一步加工。然而,因为富含油脂,其脂肪含量必须减少,目前在水产养殖中作为鱼类饲料的合法使用需要进一步加工。当幼虫被处理后,被提纯的有价值的成分可以作为产品单独销售。我们必须记住的是,可持续生产的有机原料不可能比无情地开采自然资源更便宜。因此,我们也注意到了幼虫所含有价值的生物活性物质的额外好处(图4)。由于在昆虫中含有大量跟动物和人类健康有关的抗菌(AMPs)。我们在如下单独一节中描述了这些生物活性分子的特性。
图4. 300吨的废弃物可以生产120吨幼虫,幼虫可用于动物饲料,另外,它们可分离成有价值蛋白质、脂类、甲壳素和其他生物活性物质。
图5. 红螨虫在黑水虻幼繁育箱内.照片由Marilyn Sallee提供.
 
建立稳定的昆虫养殖生态是一个挑战。例如,有几种病原体能在黑水虻的养殖环境中找到最佳繁殖条件。例如微孢子虫、线虫、顶复门寄生虫和其他杂类单细胞生物可能存在于昆虫养殖群落中,特别是在卫生条件不达标的情况下。这个问题在文献中尚未得到充分的论证。家蝇(M. domestica)在食物稀少的容器中属于营养竞争者,但更重要的是,它们可能是病原菌的载体。此外,当污染物中带有食肉性螨虫(图5)时,粮食螨虫可能会成为饲料竞争者,从而可能导致养殖环境破坏,这就要求建立无螨环境。
3.黑水虻幼虫的蛋白质和脂质评定
3.1 蛋白质
我们养殖的黑水虻幼虫脱水后蛋白质含量为42%(数据未公开)。幼虫蛋白质中氨基酸的组成决定了其作为动物饲料的品质。不同物种对于饲料的需求不同,因此对于饲料中的最适氨基酸组成也会有所不同,一些氨基酸需要额外添加到饲料中。否则,氨基酸不平衡会导致机体代谢紊乱。根据Halver和Shanks的研究发现,鱼类有十种必需氨基酸:精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。黑水虻幼虫体内存在的所有氨基酸见表1。
 
表1黑水虻和鲱鱼肉及白鱼肉氨基酸组成(%)比较 (红色:必需氨基酸;绿色:半必需氨基酸)
氨基酸组成 黑水虻 鲱鱼肉 白鱼肉
(我们的数据)
丙氨酸  6.2   6.3   6.3
精氨酸  6.2   5.8   6.4
天冬氨酸 10.3 9.1 8.5
半胱氨酸  0.5  1.0 0.9
谷氨酸 12.2  12.8 12.8
甘氨酸  5.4   6   9.9
组氨酸  4.8   2.4   2.0
异亮氨酸  4.8   4.5   3.7
 亮氨酸 7.7   7.5   6.5
赖氨酸  7.4   7.7   6.9
蛋氨酸  0.6   2.9   2.6
苯丙氨酸   6.2   3.9   3.3
脯氨酸  6.2   4.2   5.3
丝氨酸  4.1   3.8   4.8
苏氨酸  4.5   3.9   3.9
色氨酸  Not analyzed 1.2 0.9
酪氨酸  6.0   3.1   2.6
缬氨酸 6.7   5.4   4.5
       
表1中氨基酸分析结果显示了动物蛋白典型的氨基酸模式,因此黑水虻被认为是一种有价值的动物饲料来源。到目前为止,我们尚未证明不同的投喂方式能显著地改变黑水虻幼虫体内的氨基酸组成。
与鱼粉相比,黑水虻幼虫中必需氨基酸含量相当低(干物质水平)。但是,黑水虻幼虫中氨基酸的组成和鱼粉相似。饲料中一种必需氨基酸的不足会影响其它必需氨基酸的吸收,由于幼虫氨基酸组成与鱼粉相似,因此鱼类饲料生产商会对此抱有极大的兴趣。一般来说,出于生态原因,黑水虻在水产养殖中替代鱼粉是非常可取的。肉食性鱼类饲料中蛋白不能低于45%,然而对于草食性鱼类而言,饲料中蛋白质含量在15~30%对于鱼类生长是足够的。除了蛋白质以外,饲料中的其它成分也起着重要的作用。例如,虹鳟鱼饲料中最适蛋白质和脂肪含量分别为35%和15~20%。因为黑水虻幼虫富含脂质(见下面数据),这提出了一个设想,当黑水虻幼虫用作鱼类商业饲料原料时,是否可以降低饲料中脂肪的添加量。
由于黑水虻幼虫含有较高的蛋白质,因此可用作家禽和猪育种的饲料原料。例如,家禽需要18~20%的粗蛋白及一些尚不明确的营养成分,但仅有谷物饲料是不能满足其营养需求。根据年龄阶段不同,猪对粗蛋白的需求在13~21%之间。猪和家禽已经可以用素食饲料(以玉米和豆粕)来养殖,尽管它们是杂食动物,需要动物性蛋白。这就导致一个严峻的问题,因为谷物中的赖氨酸含量低,同时像大豆等豆科植物蛋氨酸含量也较低。配合饲料中,蛋氨酸是第一限制性氨基酸。满足蛋氨酸需求的一个方法是投喂过量的蛋白质,这样动物每天所需的蛋氨酸就能得到满足,但这会导致高水平的氮排泄。在家禽饲料中添加促进蛋氨酸合成的物质意味着饲料中蛋白质需求的减少,同时也能够满足蛋氨酸的日需求量。
3.2 脂质
黑水虻幼虫脱水后脂质含量为35%(数据未公开)。黑水虻幼虫脂质品质高,和其它动物和植物性脂质品质相当,例如棕榈(仁)油(图6)。和氨基酸模式不同,黑水虻幼虫脂质组成可以通过不同的饲料来改变。我们发现,对于特定饲料所饲喂的幼虫,其体内脂质组成(碳链长度)类似于棕榈(仁)油成分(图6)。
图6蛋白质、脂肪和木质磺酸盐摄入量对黑水虻幼虫脂肪酸组成的影响。相比于标准的Gainesville饲料(含30%苜蓿粉、50%麸皮、20%玉米粉,其中饲料营养成分含量:蛋白质15.3%、脂肪3.8%、纤维12.6%和灰分6.3%)。(A)日粮对饲料脂肪酸组成的影响。(B)油脂数据(https://ndb.nal.usda.gov/ndb/)。
我们用Gainesville作为标准饲料。通过在幼虫饲料中添加30%的飞虫脂肪,我们发现可以提高黑水虻幼虫体内棕榈酸和油酸的含量,并显著减少亚油酸含量。根据预期的目的(动物饲料或者工业原料),可能人为“设计”得到希望的幼虫脂肪酸组成。
黑水虻幼虫月桂酸含量高达50%,作为清洁和洗涤剂的工业原料是十分好的。幼虫中不好的芥酸不超过1.3%,可作为饲料投喂。德国自1977年规定食品中的芥酸含量不能超过5%。
4.黑水虻幼虫体内的生物活性物质及其在动物和人类福利上的潜在价值
4.1
由于黑水虻是杂食性,因此黑水虻幼虫含有对于科学和工业有益的多种降解酶。到目前为止,仅有黑水虻所含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活力被报道。在2014年。Lee等在肠道菌群中的到一种新的纤维素酶基因的异源表达,具有和糖基水解酶家族5 (Dysgonomonasmossii)72%的同一性和80%的同源性。在我们当前研究的课题中发现,一些有趣的酶如幼虫肠道中的木素酶和纤维素酶取决于饲料的组成。根据转录组分析表明,黑水虻幼虫可以生产纤维素酶,也可以生产甲壳素和木质素降解酶。我们根据这些酶的活性进行了大量的酶活体外实验,但是至今为止,还不能在体外显示出各自的活性。但是,我们通过分光光度法可以测定胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在体外(包括在幼虫肠道组织匀浆中)的活力(图7)。这些蛋白降解酶的活力表明黑水虻幼虫在生化合成中保持了酶活。
图7根据Kim等的方法测定幼虫肠道组织匀浆中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活力。基板为Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸(BapNA,83.3uM)和寡肽底物(AAPF,166.6uM)。对照组(一和二)酶活分析中底物不含幼虫肠道组织匀浆;对照组三底物为缓冲液;对照组四为空白,没有底物。
4.2 壳聚糖
从幼虫组织匀浆中萃取出蛋白和脂质后,仍有不可溶的成分留下,包括不可溶的角质层。它的主要结构组成是甲壳素,一种主要由乙酰氨基葡萄糖部分组成的多糖。它可以通过对低聚壳聚糖的水溶物进行碱性脱乙酰基制得。该物质有着比较有益的生物特性,在保健、农业以及化妆品和纺织等行业中的科学及商业应用也得到了广泛报道。该物质无毒,能生物降解,具有抗菌作用,同时也报道具有多种生物活性,因此可能被用于治疗疾病,如癌症、肥胖和老年痴呆症。壳聚糖还可促进组织再生,同时具有抗炎症作用。在重要的细胞信号激酶上的影响表明了其与细胞进程的复杂作用过程,但其机理尚未得到证明。壳聚糖可以有效地结合脂质,这些特性在医学技术上已经得到了开发利用。壳聚糖的物理特性可以用作药物的包衣以及其它的工业应用。此外,壳聚糖的O,N,S和P的衍生物由于具有理想的生物和物理特性,因而可以被制备。世界壳聚糖的生产主要来源于甲壳贝类,但是,昆虫的大量生产将会为这一有益物质提供另一种来源。
4.3 抗菌肽
黑水虻在自然界中主要以腐烂生物有机物为食,而这些有机物通常富含大量的细菌和真菌等微生物,在这样的环境中生存就需要具有强大抵抗力,因此,可以断定,黑水虻幼虫能够产生丰富的抗菌肽及其它抗生素类活性物质。
众所周知,昆虫具有发达的先天免疫系统,细分为细胞和体液免疫反应。体液免疫中的抗菌肽在脂肪体内合成并随后分泌到血淋巴中。一般来说,抗菌肽可以作为有效的抗生素或杀菌剂,特别是细胞膜及胞内物质,进而引起细胞的死亡。最近的几项研究报道,黑水虻幼虫的血淋巴和蝇蛆提取物及其分泌物的抗微生物活性,有望为新的、具有治疗价值的抗生素产品的开发提供思路,特别是用于防御多重抗性“超级细菌”(例如ESKAPE菌株葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))。在实验室中,我们使用粗制水溶性黑水虻幼虫提取物来研究其对几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌生物膜的生物活性作用,且更加详细地分析了黑水虻幼虫抗菌肽对枯草芽孢杆菌的作用机理。
4.3.1黑水虻幼虫抗菌活性提取物对细菌细胞膜的作用
细菌生物膜是由天然(生物)或人造(非生物)表面固着的单一种或多种微生物组成的动态多细胞环境。特定的环境条件,例如营养限制或pH值变化可作为生物膜变化的信号。在环境中找到的主要是混合物种的细菌生物膜,而由单一细菌物种组成的生物膜主要与传染性疾病和其他严重的医疗问题有关。慢性感染是由于非生物表面上某单一种生物膜的形成,例如,医疗植入物、导管或隐形眼镜,也有很多附着于上皮的生物膜引起难以治愈的感染性疾病(如慢性鼻窦炎或慢性骨髓炎)。另外,生物膜中的微生物对细菌周围基质引起的抗生素治疗具有极强的抵抗力,细菌周围基质由胞外聚合物(EPS)组成,包括蛋白质、多糖和DNA。目前已被广泛研究的P. aeruginosa的生物膜,一种来源于ESKAPE组的革兰氏阴性细菌,尤其是针对病人的囊性纤维化或术后感染问题,显示出杰出的致病性特征。显然,该生物体的生物膜含有大量的保护EPS的基质,使得P.pseudomonas的抗生素处理无效。革兰氏阳性病菌(金黄色葡萄球菌)也是如此。在这种情况下,金黄色葡萄球菌及其家族(例如表皮葡萄球菌)被报道能够引起60%的医院感染,并且当作为生物膜生长时,对目前使用的抗生素显示出极高的抗性。因此,寻找新的有效抗生素来挑战这些“超级臭虫”是非常重要的。由真核生物先天性免疫所产生的抗菌肽作为抵抗多重耐药菌株的药物非常有前景。近年来发现,几种抗菌肽具有影响细菌生物膜的能力。例如,人嗜中性粒细胞产生的cathelicidin LL-37对抗铜绿假单胞菌形成的生物膜和具有耐多种药物的金黄色葡萄球菌形成的生物膜非常有效。尽管有这些优点,但是目前还没有可用的商业抗菌肽能够挑战特定的生物膜感染。
图8:水溶性黑水虻幼虫提取物对微生物膜的影响。(A)水溶性黑水虻幼虫提取物(28mg幼虫/孔)和氯霉素(40μg/孔)对细菌生物膜的抗微生物作用。生物膜降解量通过550nm处的吸光度测量。(B)枯草芽孢杆菌生物膜随时间的降解关系。用几个黑水虻幼虫提取物(130mg幼虫当量)和1.75%次氯酸(对照)的稀释液处理(n = 9)。
为了研究黑水虻幼虫提取物对微生物生物膜的抗微生物作用,我们根据Park等人的方案制备水溶性幼虫提取物。来自O'Toole的方案被用来测试黑水虻幼虫提取物对分别生长在微量滴定板上的大肠杆菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌生物膜的抗微生物活性,抗生素氯霉素和化合物次氯酸作为阳性对照。在规定的培养期后,加入结晶紫,并通过测量550nm处的吸光度对剩余的生物膜进行定量。我们发现所有被测试的微生物都有很强的生物膜降解(降低了70%-90%)(见图8A),这可能是由于黑水虻提取物中的抗微生物化合物在起作用。此外,革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌或藤黄微球菌)的生物膜与革兰氏阴性菌(大肠杆菌或荧光假单胞菌)的生物膜以相同的方式受到影响。这是值得注意的,因为迄今为止仅报道了黑水虻的防御素DLP4对革兰氏阳性微生物的抗菌作用。 DLP4显然不是我们实验所使用幼虫粗提取液中唯一的抗菌肽。即使与1.75%的次氯酸相比(图8B),对枯草芽孢杆菌生物膜的强烈影响也表明可能是由几种抗菌肽协同作用的结果。
在未来的试验中,黑水虻抗菌肽以及确定抗菌物质的混合物将会被测定其对生物膜活性的影响。目前,正在开展的实验为这一途径的巨大潜力提供了依据。
4.3.2黑水虻幼虫中所含抗菌肽的分类
关于黑水虻所含有的抗菌肽,人们知之甚少。最近,Elhag等人在黑水虻的基因组中发表了7个编码抗菌肽的基因。此外,作者还描述了来自黑水虻的stomoxynZH1基因对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌活性的成功表达和功能分析。然而,从不同昆虫获得的数据表明,抗菌肽家族在昆虫之间很大程度上是保守的,并且根据它们各自的栖息地,只有不同昆虫之间抗菌肽的数量可能不同。关于昆虫抗菌肽的现有信息阐明了黑水虻幼虫期望的生物活性,因此最重要的发现可以归纳为以下几部分。
来自双翅目昆虫的抗菌肽,其抗菌活性首先在黑腹果蝇的血淋巴中由Robertson和Postlethwait发现,他们还指出,先前感染了微生物的昆虫发展出更强的体液免疫应答,伴随着抗菌肽合成的增加以抵抗微生物感染。对细菌预免疫的黑水虻幼虫粗提液的基因芯片研究揭示了几种抗菌肽的高度表达,如防御素类(4.3.2.1)、天蚕素类(4.3.2.2)、攻击素类(4.3.2.3)和双翅菌肽类(4.3.2.4)(ArianeMüller,未发表的结果)。典型地,这些类型的抗菌肽可以在双翅目昆虫中存在,并且通常是阳离子型,然而,它们的结构和序列性质不同。
4.3.2.1防御素
昆虫防御素,一种小分子(约4kDa),富含半胱氨酸的阳离子肽,含有六个保守的半胱氨酸,分子内形成三个二硫键。昆虫防御素家族也显示出与哺乳动物防御素的强烈同源性。昆虫防卫素的典型结构由N-末端环,α-螺旋和两个或三个反平行β-折叠构成。大多数昆虫防御素只对革兰氏阳性微生物具有很强的抗菌活性,如枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌。在一些罕见的情况下,昆虫防御素也可以杀死革兰氏阴性菌和/或真菌。来自双翅目昆虫(Anopheles gambiaeD. melanogaster)的防卫素和菌肽分别显示出非常有效的抗菌(革兰氏阴性菌)和抗真菌活性。来自昆虫的防御素,通过与磷脂相互作用靶向微生物的细胞质膜,随后导致膜的透化作用,并随后导致微生物细胞的死亡。
4.3.2.2天蚕素
小分子的阳离子天蚕素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌具有广泛的抗菌活性。来自鳞翅目Hyalophoracecropia的天蚕素也是第一个成功纯化的抗菌肽。值得注意的是,来自双翅目吸血飞蝇Stomoxyscalcitrans的天蚕素stomoxyn也显示出对锥体虫的抗寄生虫活性。已经知道,天蚕素的抗微生物活性也是由肽的C末端的酰胺化引起的,这与被攻击微生物的脂质体相互作用很重要。天蚕素在疏水环境(如细菌细胞膜或脂多糖)中作为螺旋结构具有杀菌活性。典型地,天蚕素由N-末端两亲性α-螺旋组成,其通过分子内铰链区与C-末端疏水性α-螺旋连接。亲水性和疏水性α-螺旋都含有对细菌细胞膜和脂多糖相互作用和至关重要的氨基酸残基。
4.3.2.3攻击素
攻击素是大分子(约20 kDa)且富含甘氨酸的螺旋抗菌肽,有两种异构体,碱性和酸性粘连素,这取决于它们的等电点。结构上,成熟的攻击素由N-末端粘连素结构域和两个富含甘氨酸的结构域组成。重要的是,攻击素对大肠杆菌和一些其他革兰氏阴性菌(如乙酸钙不动杆菌和麦芽假单胞菌)都具有抗菌活性。仅在少数病例中检测到其针对革兰氏阳性菌、真菌或寄生虫的抗菌活性。例如,来自双翅目舌蝇Glossinamorsitans的attacin-A1也杀死了布氏锥虫Trypanosomabrucei。攻击素的抗菌作用机制(MOA)是与脂多糖结合并抑制革兰氏阴性细菌外膜蛋白的合成,从而导致微生物细胞膜的高渗透性和不稳定性。
4.3.2.4双翅菌肽
具有82个氨基酸组成的双翅菌肽最初是从北方绿头蝇Phormiaterraenovae中分离出来,其与来自昆虫的已知抗菌肽(例如攻击素或蛾血素)没有直接的同源性。因此,双翅菌肽被分组为大的O-糖基化的、缺乏有序的二级-三级结构的多肽,而糖基化并非抗微生物活性强制需要的,而是防止昆虫血淋巴中肽的降解。然而,双翅菌肽能够在很短的时间(约15分钟)内抑制革兰氏阴性菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长,而不溶解哺乳动物血细胞(例如绵羊红细胞)。人们认为,双翅菌肽仅与靶分子形成特定的结构,但其确切的抑菌作用机制仍然难以捉摸。
尽管缺乏双翅菌肽的确切抑菌机制,上述其它昆虫抗菌肽同样攻击细胞膜,特别是细菌的细胞膜。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌是已知的生物模型,具有安全、“容易操作”和有效的分子和遗传特性。此外,细胞壁生物合成和信号通路对于细胞信号的完整性以及枯草芽孢杆菌的存活是必要性,这已经得到了广泛的研究。因此,枯草芽孢杆菌对于更加详细地研究昆虫抗菌肽在细菌细胞膜上的作用机制是非常适合的。
4.3.3黑水虻幼虫抗菌肽诱导枯草芽孢杆菌的细胞膜应激反应
细菌的细胞膜是抵抗环境条件破坏的第一道屏障。在自然栖息地,如土壤,枯草芽孢杆菌与其他微生物永久竞争以获得最佳生存条件。作为防御机制,包括枯草芽孢杆菌在内的许多微生物通过产生抗菌肽来抵抗来自其它微生物的竞争。这些抗生素物质主要攻击细菌的细包膜。因此,对细胞膜的完整性对于持续监测细菌细胞的存活至关重要。在枯草芽孢杆菌中,称为细胞膜应激反应(CESR)的网络负责检测影响细胞包膜完整性的信号,并通过建立修复机制和抗微生物药物耐药性将信号转导到适当的细胞应答中,从而保护细胞膜。与ABC转运蛋白相关的双组分体系作为抗性决定簇在枯草芽孢杆菌的CESR中发挥重要作用,并且已经得到很好的研究。在实验室中,我们使用这些信号转导途径开发全细胞枯草芽孢杆菌生物传感器,这些传感器对于不同类型的AMP抗菌肽具有特异性反应。此外,这些生物传感器非常可行,以表征新发现的抗生素的抑菌机制。
最近,我们发现在用黑水虻幼虫提取物(Diana Wolf,未公开的数据)处理枯草芽孢杆菌细胞后,与ABC转运蛋白相关的ApeRS双组分系统(以前称为YxdJK)具有高度诱导性。在第一个实验中,我们使用未免疫和预免疫的(具有枯草芽孢杆菌的)黑水虻幼虫粗提液来处理含有Ape生物传感器的枯草芽孢杆菌,所述Ape生物传感器包括与发光基因融合的Pape靶启动子。用于信号响应的生物传感器信号转导通过膜锚定的组氨酸激酶ApeS和磷酸盐转移至同源响应调节剂ApeR(图9A)。随后,激活的响应调节子结合到驱动报道基因(发光)表达的靶启动子Pape(图9A)。到目前为止,仅仅知道Ape系统对人类抗菌肽 LL-37有反应。我们测试的多种原核生物的抗菌肽都没有诱导Ape系统。为了测试黑水虻幼虫提取物对Ape生物传感器的诱导作用,将枯草芽孢杆菌细胞涂布在琼脂平板上。随后,将用某些黑水虻幼虫提取物浸泡的Whatman纸盘放置在琼脂平板上,将平板温育过夜,然后通过在发光机器检测(“Moon shine assay”)由于Pape启动子活性所致的发光。当使用预免疫的黑水虻幼虫提取物时,我们发现强烈的发光信号使Pape能够显示出强烈的活性(图9B)。由于缺乏对某种抗原(例如枯草芽孢杆菌)的特异性幼虫免疫应答,对于未免疫的黑水虻幼虫提取物,Pape的生物发光信号较弱(图9B)。
 
图9枯草芽孢杆菌的Ape生物传感器。(A)全细胞生物传感器的遗传组织。(B)用黑水虻幼虫提取物诱导的目标启动子Pape
总之,我们假设Ape传感器专门检测和响应真核生物抗菌肽,但Ape传感器确切的化合物特异性仍然难以捉摸。此外,由于LL-37以及昆虫抗菌肽主要影响和破坏细菌细胞膜,因此我们预期,作为CESR的一部分,Ape系统在细菌细胞膜保护中扮演重要角色-作为耐药决定子。如前文所述,昆虫的防御素和天蚕素对于抵抗革兰氏阳性菌(如枯草芽孢杆菌)非常有效。因此,通过色谱纯化黑水虻幼虫提取物,以及与Ape生物传感器协同测试纯化抗菌肽(来自其他双翅目昆虫),仍需进一步深入研究。
5总结与展望
近年来,昆虫生物技术已经非常成功。这不仅体现在研究强度的加大,而且体现在该领域新成立公司数量的增加,从而展现出商业价值。使用昆虫产品的商业潜力是基于昆虫的成功进化。黑水虻(H. illucens)很好地说明了这一点。昆虫健壮,在恶劣条件下存活,对细菌感染具有显著的抗性。这使得昆虫养殖具有吸引力,因为有可能以低质量饲料饲养幼虫,而得到较高得饲料转化率。昆虫的蛋白质和脂质的生产在生态上是理想的,因为它可以进行资源的二次利用,因此有助于保护生态系统。欧盟对动物蛋白饲料的立法,限制了大规模生产使用昆虫原料。
黑水虻幼虫提取物中的生物活性物质是非常有价值的,并将对未来昆虫养殖经济的成功发挥重要作用。我们特别注意到,黑水虻幼虫中的一些不同寻常的酶,可能在纤维素、木质素和其它惰性有机物的加工中发挥作用。此外,用于抵抗人类和动物感染中出现的常见抗生素的细菌耐药性问题,来源于黑水虻和其它昆虫的强效抗菌肽具有广阔的应用前景。
(参考文献略)
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